3R-Project 37-92

Nachweis von Clostridien-Toxinen ohne Tierversuch

Nicolet J.
Institut für Veterinärbakteriologie, Universität Bern, Bern

Duration: 3 years End of the Project: 1996

Background and Aim
Die Diagnostik und Identifikation von human- und veterinärmedizinisch relevanten Clostridien- Spezies beruht im wesentlichen auf ihrer Produktion von Exotoxinen, welche zum grössten Teil mittels Tierversuchen nachgewiesen werden müssen. Neue Erkenntnisse über die Struktur von Clostridien -Toxinen und ihrer Gene erlauben die Entwicklung von in vitro Nachweisverfahren.
Aufgrund bekannter Toxingene der verschiedenen Clostridium perfringens - Toxintypen wird in diesem Projekt ein Polymerase - Ketten - Reaktionsverfahren (PCR) zum Nachweis der alpha-, beta, sigma- und Enterotoxin entwickelt. Dadurch können die wichtigen Toxintypen von C. perfringens eindeutig ohne Tierversuche identifiziert werden. Ein wichtiges Clostridium-Spezies ist Clostridium chauvoei, bei welchem überhaupt keine Virulenzfaktoren bekannt sind. Mit biochemischen und genetischen Methoden soll versucht werden, das Hämolysin von Clostridium chauvoei zu isolieren und zu klonieren. Dieser Projektteil wird schliesslich ebenfalls zu einer spezifischen in vitro-Nachweismethode von C. chauvoei führen.

Method and Results
In order to get basic results which allow the phylogenetic localisation and identification of Clostridium chauvoei and the closely related species Clostridium septicum, we cloned and sequenced the rrs genes encoding the 16SrRNA for these species and determined their phylogenetic position in Clostridium cluster I (C. carnis, C. perfringens, C. botulinum, C. tetani). Based on DNA sequence data, we developed an identification system for C. chauvoei, using specific PCR amplification of the rrs gene with specific oligonucleotids. ... The developed identification system was evaluated on clinical material during a recent outbreak of blackleg. Thereby C. chauvoei was identified as the etiological agent of the outbreak either directly from clinical samples of muscle, liver spleen and kidney or from primary cultures made with this material.
A comparison with the standard diagnostic tools for C. chauvoei showed that the newly developed method has advantages over the immunofluorescence. Moreover, this assay is a valuable tool for the phylogenetic identification of C. chauvoei which can substitute the fastidious traditional identification and replace a considerable amount of laboratory animals traditionally used for testing.

References
1. Kuhnert P., Capaul S.E., Nicolet J. and Frey J. (1996 Phylogenetic positions of Clostridium chauvoei and Clostridium septicum based on 16S rRNA gene sequences. Int J Syst Bacteriol, 46, 1174-1176.

2. Braun M., Herholz C., Straub R., Choisat B., Frey J., Nicolet J., Kuhnert P. (2000) Detection of the ADP-ribosyltransferase toxin gene (ccl A) and its activity in Clostridum difficile isolates from Equidae. FEMS Microbiol. Lett.