3R-Project 27-92

Entwicklung und Evaluation von Methoden zum Erfassen pyrogener Substanzen

Jungi T. W.
Institut für Veterinär-Virologie, Universität Bern, Bern

Duration: 3 years End of the Project: 1996

Background and Aim
Pyrogene sind Substanzen aus Bakterien, die in geringsten Mengen in Mensch und Tier Fieberreaktionen bis hin zu lebensbedrohenden Schockzuständen auslösen können. Solche Substanzen sind weitverbreitet, und es bedarf eines grossen Aufwandes, um bei der Herstellung von Medikamenten eine Kontamination mit Pyrogenen zu vermeiden. Deshalb gehört zu jeder Qualitätskontrolle von Medikamenten oder Infusionslösungen der Nachweis, dass diese pyrogenfrei sind. Der klassische Pyrogen-Test ist ein Tierversuch und beruht auf der Messung der Temperatur nach Verabreichung der zu testenden Substanz.
Eine wichtige Gruppe von Pyrogenen, die Endotoxine, können in vitro im sog. Limulus- Amoebozyten- Lysat- Test (LAL-Test) gemessen werden. Dieser Test, obwohl für gewisse Substanzklassen als Pyrogentest heute in vielen Ländern akzeptiert, ist störungsanfällig und widerspiegelt nur ungenügend das Vorliegen von Substanzen, die auf Mensch und Tier pyrogen wirken. Im vorliegenden Projekt werden menschliche Zell-Linien selektioniert oder durch Transfektion erzeugt, die ein in vitro-Korrelat der Pyrogen- Reaktion bei Mensch und Tier darstellen.

Method and Results
Es konnte gezeigt werden, dass sich gewisse menschliche monozytoide Zell-Linien als hochsensitive Indikatoren von Endotoxin (in der Praxis die wichtigsten Pyrogene) eignen. Ausgehend von zwei verfügbaren Zell-Linien konnten Sublinien kloniert werden, die (1) empfindlicher sind als die Ausgangszell-Linie, (2) über viele (>50) Passagen hinweg stabil sind. Das Kultursystem für diese Klone wurde optimiert, und als Pyrogen- Indikator wurde aus mehreren möglichen Parametern die Sekretion von Tumor-Nekrose-Faktor ausgewählt, da sich dies als empfindlichste Messgrösse erwies, mit der Pyrogen- Exposition nachzuweisen war. Ausserdem ist die Menge von hoher Relevanz für eine Pyrogen-Reaktion in vivo.
Die drei Klone wurden einerseits auf Ansprechen auf eine breite Palette von gereinigten Pyrogenen geprüft. Anderseits wurden Pyrogen- kontaminierte und nicht kontaminierte Proben aus der industriellen Produktion gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mit verschiedenen Varianten des Limulus-Tests sowie mit dem Kaninchen-Pyrogen-Test verglichen. Es zeigte sich, dass sich der Zellkulturtest von der Sensitivität wie von der Spezifität her als Pyrogen-Test sehr gut eignet, mit der einzigen Ausnahme der Pyrogene von gram-positiven Erregern.

References
(1) Eperon S, Jungi TW. The use of human monocytoid lines as indicators of endotoxin. J Immunol Methods. 1996;194:121-129.

(2) Eperon S, De Groote D, Werner Felmayer G, Jungi TW. Human monocytoid cell lines as indicators of endotoxin. Comparison with rabbit pyrogen and Limulus amoebocyte lysate assay. J Immunol Methods. 1997;207:135-145.

(3) Jungi TW, Brcic M, Eperon S. Human macrophages respond to LPS in a serum-independent, CD14- dependent manner. Immunol Lett. 1996;54:37-43.

(4) Peterbauer A, Eperon S, Jungi TW, Werner ER, Werner-Felmayer G. Interferon-gamm-primed monocytoid cell lines: optimizing their use for in vitro detection of bacterial pyrogens. J Immunol Methods. 2000;233:67-76.