3R-Project 30-92

Toxikologische Untersuchung der Blutbildung in vitro

Ryffel B.
vormals Institut für Toxikologie, der ETH und Universität Zürich, Scherzenbach

Duration: 2 years End of the Project: 1994

Background and Aim
Ziel dieses Projektes war die Etablierung von in vitro Methoden zur Abklärung von Xenobiotika-Effekten auf das blutbildende Knochenmark. Für diese Untersuchungen werden einerseits etablierte Zell-Linien und anderseits Primärkulturen von Maus und Mensch eingesetzt. Für die Bestimmung allgemein-toxischer Endpunkte, wie z.B. Zytotoxizität, Protein und DNS Synthesen sind Zell-Linien geeignete Modelle.
Die komplexen Ereignisse der Blutbildung (Hämatopoiese), wie Proliferation von verschiedenen Vorläuferzellen, Differenzierung und Reifung wird an Primärkulturen von Maus- und Humanknochenmark mittels der sogenannten Kolonien-Assays durchgeführt. Substanzeffekte auf frühe und späte erythroide Granulozyten- Monozyten und gemische Vorläufer werden erfasst.
Diese Untersuchungen sind für in vitro Screening Tests von Substanzen mit vermuteter Toxizität auf das Knochenmark geeignet.

Method and Results
Es wurden im wesentlichen folgende Teilprojekte bearbeitet:
1. Etablierung der in vitro Kultur von Knochenmarkzellen: eine Flüssigkultur über 4 Tage gestattet Substanzeffekte auf sehr frühe Vorläuferzellen der Blutbildung.
2. Untersuchungen an Knochenmarkszell-Linien: Dabei lag der Schwerpunkt auf dem Effekt von Immunsuppressivsubstanzen, insbesondere auch Zytokin-Inhibitoren wie Rapamycin, Worthmanine, daneben auch Chemotherapeutika.
3. Nachweis von Wachstumsfaktoren: Neben dem Proteinnachweis wurde auch eine sehr sensitive Methode des mRNS Nachweises eingesetzt: die PCR mittels eines im Hause modifizierten Vektors P-mus, das den Nachweis fast aller Zytokine gestattet.
4. Flow- zytometrische Untersuchung des Knochenmarks: Mit einem Flowzytometer (FACScan) und mit einem Laserscanningmikroskop konnten mit Verwendung spezieller Antikörper die Zugehörigkeit von einzelnen Zelltypen im Knochenmark charakterisiert werden.
5. Rezeptoruntersuchungen an Knochenmarks-Zell-Linien, besonders an IL-3 und GM-CSF. Diese Untersuchungen am Mäuseknochenmark sind ein guter Ausgangspunkt für ein breites Screening von Effekten zur Unterdrückung der Blutbildung.

References
1. In vitro Tox 6, 67-79, 1993.
2. Exp Med 181, 1893-1898, 1995.